Потклонирање

Во молекуларната биологија, потклонирањето е техника која е користена за преместување на одредена секвенца на ДНК од „родителскиот вектор“ до „одредишниот вектор“.

Оваа слика ја прикажува постапката на субклонирање како што е наведено лево.

Субклонирањето не треба да биде мешано со молекуларното клонирање кое е поврзана техника.

Постапка

Рестрикционите ензими се користени за акцизирање на генот од интерес (внесот) од родителот. Вметнувањето е прочистено со цел да биде изолирано од други молекули на ДНК. Вообичаен метод за прочистување е гелната изолација. Бројот на копии на генот потоа е засилуван со помош на полимеразна верижна реакција.

Истовремено, истите рестрикциони ензими се користење за варење (сечење) на одредиштето. Идејата зад користењето на истите рестрикциони ензими е да бидат создадени комплементарни лепливи краеви, што ќе го олесни врзувањето подоцна. Фосфатаза, најчесто калф-цревна алкална фосфатаза, исто така е додавана за да биде спречена самолигацијата на одредишниот вектор. Сварениот одредишен вектор е изолиран/прочистен.

Вметнувањето и одредишниот вектор потоа се мешани заедно со ДНК-лигазата. Вообичаен моларен сооднос на вметнати гени со одредишните вектори е 3:1; со зголемување на концентрацијата на внесот, самолигацијата дополнително е намалувана. Откако ќе биде оставена реакционата смеса да отстои одредено време на одредена температура (во зависност од големината на нишките што се врзуваат; за повеќе информации видете ДНК-лигаза), внесот треба успешно да биде вметнат во одредишниот плазмид.

Засилување на производот плазмид

Плазмидот често е преобразуван во бактерија како што е E. coli. Идеално, кога бактеријата се дели, плазмидот исто така треба да се реплицира. Во најдоброто сценарио, секоја бактериска клетка треба да има неколку копии од плазмидот. Откако ќе пораснат добар број бактериски колонии, тие може да се миниприпремат за да биде собрана плазмидната ДНК.

Одбирање

Со цел да биде обезбеден раст само на преобразбените бактерии (кои ги носат саканите плазмиди што треба да бидат собрани), користен е обележувачки ген во одредишниот вектор за одбирање. Вообичаени обележувачки гени се за отпорност на антибиотици или биосинтеза на хранливи материи. Така, на пример, „обележувачкиот ген“ може да биде за отпорност на антибиотикот ампицилин. Ако бактериите што требале да го подигнат саканиот плазмид што го зел саканиот ген, тогаш тие исто така ќе го содржат „обележувачкиот ген“. Сега бактериите што го зеле плазмидот ќе можат да растат во ампицилин, додека бактериите што не го зеле саканиот плазмид сè уште ќе бидат ранливи на уништување од ампицилинот. Затоа, би биле успешно „одбрани“ преобразените бактерии.

Пример случај: бактериско плазмидно субклонирање

Во овој пример, ген од генската библиотека на цицачи ќе биде субклониран во бактериски плазмид (одредишна платформа). Бактерискиот плазмид е парче кружна ДНК што содржи регулаторни елементи што им овозможуваат на бактериите да произведат генски производ (генско изразување) доколку се стави на правилно место во плазмидот. Местото за производство е опколено со две места за сечење на рестрикциониот ензим „А“ и „Б“ со неодговарачки лепливи краеви.

ДНК на цицачите не доаѓа со овие рестрикциони места, така што тие се вградени со преклопено продолжение на полимеразната верижна реакција. Зачетниците се дизајнирани да ги поставуваат местата за ограничување внимателно, така што кодирањето на белковината е во рамката, а минимум дополнителни аминокиселини се поставувани на двете страни од белковината.

И производот направен со полимеразна верижна реакција, што го содржи генот на цицачите со новите рестрикциони места и одредишниот плазмид се подложени на рестрикционо варење, а производите за варење се прочистувани со гелна електрофореза.

Производите за варење, кои сега содржат одговарачки лепливи краеви еден со друг (но неодговарачки лепливи краеви со себе) се подложени на лигатура, создавајќи нов плазмид кој ги содржи елементите на позадината на првобитниот плазмид со различно вметнување.

Плазмидот се преобразува во бактерии и идентитетот на внесот е потврдуван со секвенционирањето на ДНК.

Поврзано

• Клонирање
• Молекуларно клонирање
• Полимеразна верижна реакција
• ТА клонирање