Форензичка ДНК анализа

Форензичка ДНК анализа — определување на ДНК анализа за правни и истражни цели. Методите за анализа на ДНК се менувале безброј пати во текот на годините како што се менувала технологијата и овозможува да се утврдат повеќе информации помал почетен материјал. Современата ДНК анализа се заснова на статистичка пресметка на реткоста на направената анализа на населението.

ДНК двојна спирала

Иако е најпозната како алатка во форензичките истраги, оваа анализа може да се користи и за нефорензички цели, како што се тестови за татковство и човечко генеалошко истражување.

Историја

Методите за изготвување на ДНК анализа биле развиени од Алек Џефрис и неговиот тим во 1985 година. Џеферис открил дека непознат примерок од ДНК, како што се крв, коса, плунка или сперма, може да се анализира и може да се развие уникатен модел/профил на ДНК. Една година по неговото откритие, Џеферис бил замолен да ја искористи својата нова пронајдена ДНК анализа за да осуди човек за кој полицијата верувала дека е одговорен за 2 убиства на силување. Џеферис докажал дека човекот е невин користејќи ДНК од местото на злосторството.

Кога за прв пат била откриена ДНК анализата, се користел процес наречен ограничувачки фрагмент на полиморфистичка должина (ОФПД) за анализа на ДНК. Сепак, ОФПД бил неефикасен процес поради фактот што користел големи количини на ДНК што не можело секогаш да се добие од местото на злосторството. Современата технологија еволуирала надвор од ОФПД. Анализата за краткото тандемско повторување (КТП) е современиот денешен еквивалент на ОФПД. Не само што КТП анализата користи помалку примерок за анализа на ДНК, туку е и дел од поголем процес наречен полимеразна верижна реакција (ПВР). ПВР е процес кој може да се користи за брзо репродуцирање до милијарда копии од единствен сегмент на ДНК.

Методи

Поранешни методи

ОФПД анализа

Шест индивидуи со различен број повторувања на едно место во нивниот геном прикажани на гел.

Првиот вистински метод за анализа на ДНК била анализа на ограничувачки фрагмент на полиморфистичка должина. Првата употреба на ОФПД анализата во форензичката работа била во 1985 година во Обединетото Кралство. Овој тип на анализа користел тандем повторувања со променливи броеви (ТППБ) за да се направи разлика помеѓу поединците. ТППБ се вообичаени низ геномот и се состојат од истата ДНК секвенца која се повторува повторно и повторно. Различни поединци може да имаат различен број повторувања на одредено место во геномот. На пример, лицето А може да има четири, додека лицето Б може да има 5 повторувања. Разликите биле визуелизирани преку процес наречен гел електрофореза. Помалите фрагменти би патувале подалеку низ гелот отколку поголемите фрагменти што ги одвојуваат. Овие разлики се користеле за да се направи разлика помеѓу поединци и кога повеќе ТППБ страници се работеле заедно, ОФПД анализата има висок степен на индивидуализирачка моќ.

Процесот на ОФПД анализа траел исклучително време и поради должината на употребените повторувања, помеѓу 9 и 100 базни парови, методите за засилување како што е полимеразната верижна реакција не можеле да се користат. Ова го ограничило ОФПД на примероци кои веќе имале на располагање поголемо количество на ДНК за почеток и не биле добри со деградирани примероци. ОФПД анализата била примарен тип на анализа што се изведувала во повеќето форензички лаборатории пред конечно да биде повлечена и заменета со понови методи. Таа била целосно напуштена од ФБИ во 2000 година и заменета со КТП анализа.

DQ алфа тестирање

Лента за тестирање DQ алфа што покажува позитивен резултат. Пополнетите точки ги претставуваат вредностите на алели за тој примерок.

Развиена во 1991 година, DQ алфа тестирањето станала првата форензичка ДНК техника која користи полимеразна верижна реакција (ПВР). Оваа техника овозможила користење на многу помалку ќелии од ОФПД анализата, што ја прави покорисна за местата на злосторството кои немаат големи количини на ДНК материјал што претходно се барало. Локусот (или местото) на DQ алфа 1 исто така билполиморфен и имала повеќе различни алели кои може да се користат за ограничување на групата на поединци кои можеле да го создадат тој резултат и да ја зголемат веројатноста за исклучување.

Локусот DQ алфа бил комбиниран со други локуси во комерцијално достапен комплет наречен Полимаркер во 1993 година Полимаркерот бил претходник на современите комплети за мултиплексирање и дозволувал да се испитаат повеќе различни локуси со еден производ. Иако е почувствителен од ОФПД анализата, Полимаркерот не ја содржи истата дискриминаторска моќ како постарото тестирање ОФПД. До 1995 година, научниците направиле обиди да се вратат на анализа базирана на ТППБ комбинирана со ПВР технологија наречена полиморфизм на должината на амплифицираните фрагменати (AmpFLP).

AmpFLP

Агарозен гел што го покажува локусот D1S80 работи во повеќе ленти користејќи AmpFLP.

AmpFLP бил првиот обид да се спои VNTR анализата со ПВР за форензичка работа. Овој метод користел пократки VNTR од ОФПД анализата, помеѓу 8 и 16 базни парови. Пократките големини на базни парови на AmpFLP биле дизајнирани да работат подобро со процесот на засилување на ПВР. Со надеж дека оваа техника ќе ја овозможи дискриминаторската моќ на ОФПД анализата со способност за обработка на примероци кои имаат помалку шаблонска ДНК за работа или кои на друг начин биле деградирани. Сепак, само неколку места биле потврдени за форензичките апликации за работа со AmpFLP анализата бидејќи форензичките лаборатории брзо преминале на други техники и ја ограничиле неговата дискриминаторна способност за форензички примероци.

Техниката на крајот никогаш не била широко користена иако сè уште се користи во помалите земји поради нејзината пониска цена и поедноставно поставување во споредба со поновите методи. До крајот на 1990-тите, лабораториите започнале да се префрлаат на понови методи, вклучително и кратко тандемско повторување. Тие користеле уште пократки фрагменти од ДНК и може посигурно да се засилат со користење на ПВР, додека сè уште ја одржуваа и подобрувале дискриминаторската моќ на постарите методи.

Тековни методи

КТП анализа

Делумен електроферограм произведен преку STR анализа.

Анализата на кратко тандемско повторување (КТП) е примарен тип на форензичка ДНК анализа која се изведува во современите ДНК лаборатории. КТП анализата се надоврзува на ОФПД и AmpFLP користени во минатото со намалување на големината на повторливите единици, на 2 до 6 базни парови и со комбинирање на повеќе различни локуси во една ПВР реакција. Овие комплети за анализа на мултиплексирање можат да произведат вредности на алели за десетици различни локуси низ геномот истовремено ограничувајќи го времето потребно за да се добие целосен, индивидуализиран, профил. КТП анализата станала златен стандард за ДНК профилирање и интензивно се користи во форензичките апликации.

КТП анализата може да биде ограничена само на Y хромозомот. Анализата Y-КТП може да се користи во случаи кои вклучуваат татковство или во семејно пребарување бидејќи Y хромозомот е идентичен по татковската линија (освен во случаите кога се случила мутација). Одредени комплети за мултиплексирање ги комбинираат автосомните и Y-КТП локуси во еден комплет, дополнително го намалуваат времето потребно за да се добијат голем број податоци.

Во моментов, КТП анализата бара повеќе клетки за да се создаде целосен ДНК профил. Сепак, науката е се поблиску до создавање целосен профил на ДНК користејќи КТП анализа на единечни клетки.

мтДНК секвенционирање

Секвенционирањето на митохондриската ДНК е специјализирана техника која користи посебна митохондриската ДНК присутна во повеќето клетки. Оваа ДНК се пренесува по мајчината линија и не е единствена помеѓу поединци. Сепак, поради бројот на митохондриите присутни во клетките, мтДНК анализата може да се користи за високо деградирани примероци или примероци каде КТП анализата нема да произведе доволно податоци за да биде корисна. мтДНК е присутна и на локации каде што би отсуствувала автосомната ДНК, како на пример во шахтите на косата.

Поради зголемената шанса за контаминација кога се работи со мтДНК , неколку лаборатории обработуваат митохондриски примероци. Оние кои имаат специјализирани протоколи кои дополнително ги одвојуваат различните примероци еден од друг за да се избегне вкрстена контаминација.

Брза ДНК

Брзата ДНК е технологија „надвор во профилот на брис“ која целосно го автоматизира целиот процес на екстракција, засилување и анализа на ДНК. Брзите ДНК инструменти се способни да преминат од брис до ДНК анализа единствено за 90 минути и ја елиминираат потребата од обучени научници за извршување на процесот. Овие инструменти се разгледуваат за употреба во процесот на резервација на прекршителот што им овозможува на полициските службеници да ја добијат ДНК анализата на лицето кое е уапсено.

Неодамна, во Соединетите Американски Држави бил усвоен Законот за брза ДНК од 2017 година, кој му наложила на ФБИ да создаде протоколи за имплементација на оваа технологија низ целата земја. Во моментов, ДНК добиена од овие инструменти не е подобна за поставување во националните бази на податоци на ДНК бидејќи тие не анализираат доволно локуси за да го исполнат стандардниот праг. Сепак, повеќе полициски агенции веќе користат инструменти брза ДНК за собирање примероци од луѓе уапсени во нивната област. Овие местни ДНК бази на податоци не се предмет на федерални или државни регулативи.

Масовно паралелно секвенционирање

Исто така познато како секвенционирање од следната генерација, масовното паралелно секвенционирање (МПС) се надоврзува на КТП анализа со воведување директно секвенционирање на локусите. Наместо бројот на повторувања присутни на секое место, МПС ќе му ја даде на научникот вистинската секвенца на базни парови. Теоретски МПС има способност да прави разлика помеѓу идентични близнаци бидејќи случајните точкести мутации би можеле да се видат во повторените сегменти кои не би биле забележани со традиционалната КТП анализа.

Реткост на анализа

Кога ДНК-анализата се користи на доказен начин, се дава статистика за совпаѓање која објаснува колку е редок профилот во популацијата. Поточно, оваа статистика е веројатноста дека лицето избрано по случаен избор од популација ќе го има тој специфичен ДНК профил. Не е веројатно дека профилот се „совпаѓа“ со некого. Постојат повеќе различни методи за одредување на оваа статистика и секој се користи од различни лаборатории врз основа на нивното искуство и преференци. Сепак, пресметките на коефициентот на веројатност стануваат префериран метод во однос на другите два најчесто користени методи, неисклучен случајниот човек и комбинираната веројатност за вклучување. Статистиката за совпаѓање е особено важна во интерпретацијата на мешавината каде што има повеќе од еден придонесувач за ДНК профил. Кога овие статистики се дадени во судница или во лабораториски извештај, тие обично се даваат за трите најчести раси од таа специфична област. Ова е затоа што алелските фреквенции на различни локуси се менувале врз основа на потеклото на поединецот. https://strbase.nist.gov/training/6_Mixture-Statistics.pdf Архивирано на 15 август 2022 г.

Случаен човек

Веројатноста произведена со овој метод е веројатноста дека лицето по случаен избор од популацијата не може да биде исклучено од анализираните податоци. Овој тип на статистика за совпаѓање е лесно да се објасни во судница на поединци кои немаат научна основа, но исто така губи голема моќ за дискриминација бидејќи не го зема предвид генотипот на осомничениот. Овој пристап најчесто се користи кога примерокот е деградиран или содржи толку многу придонесувачи што не може да се одреди единствен профил. Исто така е корисно да им се објасни на лаиците бидејќи методот за добивање на статистиката е јасен. Меѓутоа, поради неговата ограничена моќ за дискриминација, овој метод генерално не се изведува освен ако не може да се користи друг метод. Овој метод не се препорачува за употреба во податоци што укажуваат на присуство на мешавина.

Комбинирана веројатност за вклучување/исклучување

Профил на еден извор кој покажува два алели во локусот vWA.

Мешавина од три лица која покажува четири алели на локусот vWA.

Комбинираната веројатност за вклучување или исклучување ја пресметува веројатноста дека случајно, неповрзано лице би придонесувало за ДНК анализа или мешавина на ДНК анализа. Во овој метод, статистиката за секој поединечен локус се определува со помош на статистика на населението и потоа се комбинира за да се добие вкупниот CPI или CPE. Овие пресметки се повторуваат за сите достапни места со сите достапни податоци и потоа секоја вредност се множи заедно за да се добие вкупната комбинирана веројатност за вклучување или исклучување. Бидејќи вредностите се множат заедно, може да се постигнат екстремно мали бројки со користење на CPI. CPI или CPE се смета за прифатлива статистичка пресметка кога е индицирана мешавина. https://www.promega.com/-/media/files/resources/conference-proceedings/ishi-15/parentage-and-mixture-statistics-workshop/generalpopulationstats.pdf?la=en

Пример пресметка за профил со еден извор

Веројатност дека човек припадник на европеидна раса има 14 алели на vWA = .10204

Веројатност дека човек припадник на европеидна раса има 17 алел на vWA = .26276

Веројатност дека човек припадник на европеидна раса има или 14 или 17 алел (P) = .10204 + .26276 = .3648

Веројатност за присуство на други алели (Q) = 1 - P или 1 - .3648 = .6352

Веројатност за исклучување за vWA = Q² + 2Q(1-Q) или .6352² + 2(.6352)(1 - .6352) = .86692096 ≈ 86.69%

Веројатност за вклучување за vWA = 1 - CPE или 1 - .86692096 = .13307904 ≈ 13.31%

Пример пресметка за профилот на смесата

Веројатност дека човек припадник на европеидна раса има 14 алели на vWA = .10204

Веројатност дека човек припадник на европеидна раса има 15 алели на vWA = .11224

Веројатност за човек припадник на европеидна раса да има 16 алели на vWA = .20153

Веројатност за човек припадник на европеидна раса да има 19 алел на vWA = .08418

Веројатност дека човек припадник на европеидна раса има некој од 14, 15, 16 или 19 алели (P) = .10204 + .11224 + .20153 + .08418 = .49999

Веројатност за присуство на други алели (Q) = 1 - P или 1 - .49999 = .50001

Веројатност за исклучување за vWA = Q² + 2Q(1-Q) или .50001² + 2(.50001)(1 - .50001) = .7500099999 ≈ 75%

Веројатност за вклучување за vWA = 1 - CPE или 1 - .7500099999 = .2499900001 ≈ 25%

Сооднос на веројатност

Коефициентите на веројатност (LR) претставуваат споредба на две различни веројатности за да се утврди која е поверојатна. Кога тоа вклучува судење, LR е веројатноста за аргументот на обвинителството наспроти веројатноста за аргументот на одбраната со оглед на нивните почетни претпоставки. Во ова сценарио, веројатноста на обвинителството е често еднаква на 1 бидејќи претпоставката е дека обвинителството нема да го гони осомничениот освен доколку тоа не е апсолутно сигурно (100%) дека ја имаат вистинската личност. Коефициентите на веројатност стануваат се почести во лабораториите поради нивната корисност во прикажувањето на статистика за податоци што укажуваат на повеќе придонесувачи, како и нивната употреба во софтвер за веројатна генотипизација што ги предвидува најверојатните алелски комбинации дадени збир на податоци.

Недостатоците со користењето на коефициентите на веројатност е тоа што е многу тешко да се разбере како аналитичарите дошле до одредена вредност и математиката вклучена станува многу комплицирана бидејќи повеќе податоци се воведуваат во равенките. Со цел да се справат со овие проблеми во судница, некои лаборатории поставиле „вербална скала“ што ја заменува вистинската бројчена вредност на соодносот на веројатност.